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SCIEX液相色譜串聯質譜系統測定微量血中的脂溶性維生素
來源:SCIEX中國公司
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作者:SCIEX中國公司
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發布時間: 2019-05-30
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維生素是維持身體健康所必需的一類有機化合物。這類物質在體內既不能是構成身體組織的原料，也不是能量的來源，而是一類調節物質，在物質代謝中起重要作用。
引言
脂溶性維生素(Liposoluble Vitamins) 包括維生素A、維生素D、 維生素E、維生素K，不溶于水而溶于脂肪及有機溶劑，由長的碳 氫鏈或稠環組成的聚戊二烯化合物。維生素是維持身體健康所必需 的一類有機化合物。這類物質在體內既不能是構成身體組織的原 料，也不是能量的來源，而是一類調節物質，在物質代謝中起重要 作用。維生素A：維持正常視覺，維持上皮細胞、組織完整，增強 機體免疫力，參與鐵代謝；維生素E：抗氧化、清除自由基，保護 神經功能，增強機體免疫力，維持正常生育功能；維生素D：維持 骨骼發育，調節抗原提呈細胞的分化、淋巴細胞的增值，影響免疫 力、智力發育；維生素K：參與凝血因子的合成，參與骨鈣素的合 成。
本方法首先采用液液萃取方法對生物樣本進行前處理，然 后SCIEX液相色譜串聯質譜系統系統，以待測目標物的同位素 標記物為內標，檢測人血清中維生素A (VA)、25-羥基維生素 D2（25OHVD2）、25-羥基維生素D3（25OHVD3）、維生素E （VE）、維生素K1 (VK1)。
實驗部分
樣品處理：向1.5 mL EP管中，依次加入10 μL內標工作液(表 2)、50 μL全血和140 μL甲醇；渦旋20秒，混勻；再加入0.6 mL正己 烷，3,000 r/min渦旋100 s，然后10,000 rpm離心3分鐘；取離心后 的上清液，在氮氣下吹干。殘渣用100 μL 80%甲醇復溶、離心， LC-MS/MS進樣20 μL分析。
色譜條件：
色譜柱使用Phenomenex kinetex C18 column (50×3.0 mm, 2.6 μm）進行分離，流動相選用水（含0.1% 甲酸）作為A相，和 甲醇（含0.1% 甲酸）作為B相，柱溫設為40 ℃，進樣量為20 μL； 進行梯度洗脫，液相梯度見表2。
質譜條件：
使用SCIEX TripleQuad? 4500MD質譜系統。采用Heated Nebulizer（APCI）和多反應監測（Multiple Reaction Monitoring， MRM）模式進行質譜掃描。離子源參數：加熱氣（GS1）為 60 psi，脫溶劑氣溫度為550 ℃；氣簾氣（Curtain Gas，CUR） 為35 psi，碰撞氣（Collision Gas，CAD）為6 psi；霧化器電流 （Nebulizer Current, NC)：5 μA。為了獲取較好的穩定性和靈敏度，各化合物監測離子對的去簇電壓（Declustering Potential， DP）和碰撞電壓（Collision Energy，CE），目標物定量離子對、定 性離子對以及內標物監測離子對等參數均經過系統優化，離子對信 息見表3。
結果與討論
圖1 VA、25OHVD2、25OHVD3、VE和VK1在定量下限LOQ提 取離子流圖。圖2是人全血中VA、25OHVD2、25OHVD3、VE和 VK1的提取離子流色譜圖，峰型對稱，響應良好。
VA、25OHVD2、25OHVD3、VE和VK1回歸方程和線性范圍見 表3，VA、25OHVD2、25OHVD3、VE和VK1在相應的濃度范圍內 線性良好，r均大于0.996。
為了考察方法的重現性及準確性，分別進行VA、25OHVD2、 25OHVD3、VE和VK1的精密度(RSD)和準確度方法驗證。從表4可以 看出，VA、25OHVD2、25OHVD3、VE和VK1低、中、高濃度的精 密度均在10%以內，準確度均在88-108%之內。
總結
本方法使用SCIEX 高靈敏度和高穩定性的液相色譜串聯質譜系 統，實現了同時檢測人全血中VA、25OHVD2、25OHVD3、VE和 VK1濃度，本方法可對人全血中脂溶性維生素進行快速的定性和定 量分析。該方法具有線性好、準確度高等優點，且每個樣本分析僅 需6.5 min，具有較高的分析通量。
脂溶性維生素(Liposoluble Vitamins) 包括維生素A、維生素D、 維生素E、維生素K，不溶于水而溶于脂肪及有機溶劑，由長的碳 氫鏈或稠環組成的聚戊二烯化合物。維生素是維持身體健康所必需 的一類有機化合物。這類物質在體內既不能是構成身體組織的原 料，也不是能量的來源，而是一類調節物質，在物質代謝中起重要 作用。維生素A：維持正常視覺，維持上皮細胞、組織完整，增強 機體免疫力，參與鐵代謝；維生素E：抗氧化、清除自由基，保護 神經功能，增強機體免疫力，維持正常生育功能；維生素D：維持 骨骼發育，調節抗原提呈細胞的分化、淋巴細胞的增值，影響免疫 力、智力發育；維生素K：參與凝血因子的合成，參與骨鈣素的合 成。
本方法首先采用液液萃取方法對生物樣本進行前處理，然 后SCIEX液相色譜串聯質譜系統系統，以待測目標物的同位素 標記物為內標，檢測人血清中維生素A (VA)、25-羥基維生素 D2（25OHVD2）、25-羥基維生素D3（25OHVD3）、維生素E （VE）、維生素K1 (VK1)。
實驗部分
樣品處理：向1.5 mL EP管中，依次加入10 μL內標工作液(表 2)、50 μL全血和140 μL甲醇；渦旋20秒，混勻；再加入0.6 mL正己 烷，3,000 r/min渦旋100 s，然后10,000 rpm離心3分鐘；取離心后 的上清液，在氮氣下吹干。殘渣用100 μL 80%甲醇復溶、離心， LC-MS/MS進樣20 μL分析。
色譜條件：
色譜柱使用Phenomenex kinetex C18 column (50×3.0 mm, 2.6 μm）進行分離，流動相選用水（含0.1% 甲酸）作為A相，和 甲醇（含0.1% 甲酸）作為B相，柱溫設為40 ℃，進樣量為20 μL； 進行梯度洗脫，液相梯度見表2。
質譜條件：
使用SCIEX TripleQuad? 4500MD質譜系統。采用Heated Nebulizer（APCI）和多反應監測（Multiple Reaction Monitoring， MRM）模式進行質譜掃描。離子源參數：加熱氣（GS1）為 60 psi，脫溶劑氣溫度為550 ℃；氣簾氣（Curtain Gas，CUR） 為35 psi，碰撞氣（Collision Gas，CAD）為6 psi；霧化器電流 （Nebulizer Current, NC)：5 μA。為了獲取較好的穩定性和靈敏度，各化合物監測離子對的去簇電壓（Declustering Potential， DP）和碰撞電壓（Collision Energy，CE），目標物定量離子對、定 性離子對以及內標物監測離子對等參數均經過系統優化，離子對信 息見表3。
結果與討論
圖1 VA、25OHVD2、25OHVD3、VE和VK1在定量下限LOQ提 取離子流圖。圖2是人全血中VA、25OHVD2、25OHVD3、VE和 VK1的提取離子流色譜圖，峰型對稱，響應良好。
VA、25OHVD2、25OHVD3、VE和VK1回歸方程和線性范圍見 表3，VA、25OHVD2、25OHVD3、VE和VK1在相應的濃度范圍內 線性良好，r均大于0.996。
為了考察方法的重現性及準確性，分別進行VA、25OHVD2、 25OHVD3、VE和VK1的精密度(RSD)和準確度方法驗證。從表4可以 看出，VA、25OHVD2、25OHVD3、VE和VK1低、中、高濃度的精 密度均在10%以內，準確度均在88-108%之內。
總結
本方法使用SCIEX 高靈敏度和高穩定性的液相色譜串聯質譜系 統，實現了同時檢測人全血中VA、25OHVD2、25OHVD3、VE和 VK1濃度，本方法可對人全血中脂溶性維生素進行快速的定性和定 量分析。該方法具有線性好、準確度高等優點，且每個樣本分析僅 需6.5 min，具有較高的分析通量。
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